项目简介
CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因编辑工具酶，在科研领域被广泛应用，而在临床方面的应用因为其脱靶活性一度停滞不前。它通过guide RNA（gRNA）与靶向DNA序列的配对，从而将Cas9锚定在靶向基因并诱导产生DNA双链断裂（DSB）。在基因编辑诱发的DSB的修复过程中，一定几率会产生基因突变或者外源DNA片段的插入，从而达到基因编辑的目的。在实际应用过程中，一个好的基因编辑酶Cas9需要同时满足高效切割靶位点、低脱靶活性和低染色体异常三个特点。目前在这三个方面，有一部分基于PCR的方法用于估算基因编辑效率，但其结果可靠性有待提高；有一些基于高通量测序的方法可以在体内或者体外检测基因编辑酶的脱靶活性；尚无系统的可定量的测量基因组异常结构的方法。本项目开发了一种新的方法，可以用来同时定量检测Cas9编辑效率和脱靶活性以及编辑引起的染色体异常结构，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。这是对基因编辑和DNA损伤修复等领域都有巨大促进作用的新技术。与此同时，该项目包括了该团队利用PEM-seq筛选出的一个相比于现有Cas9变体具有更低脱靶活性且与野生型Cas9切割效率相当的Cas9变体further enhanced Cas9 (FeCas9)。
应用范围
无论是在临床应用还是科学研究领域，利用本项目的可以精确定量的优势，PEM-seq可以公平地从高切割效率，低脱靶活性以及低染色体异常结构三个维度中的任意维度筛选出针对某基因进行编辑时最优的Cas9种类的以及gRNA序列，获取经济并且安全的基因编辑策略（图1）；与此同时，可以利用PEM-seq筛选出新的具有高切割效率且低脱靶活性的Cas9受体，降低基因编辑的负面影响，推动基因编辑领域的发展；也可以利用该项目直接筛选出的FeCas9基因编辑酶进行基因编辑减少基因编辑脱靶活性带来的危害（图2）。
图1. 该团队利用PEM-seq, 筛选出编辑RAG1基因的最优编辑酶Cas9:RAG1B
图2. 该团队利用PEM-seq, 筛选出更加优异的Cas9变体FeCas9 (右图柱状图上数字代表相应Cas9脱靶位点的数目)
项目阶段
该项目团队已经将PEM-seq，利用PEM-seq筛选基因编辑酶以及FeCas9在国际刊物上发表（Cell Discovery, 2019）。
目前该团队正进一步研究如何在基因编辑过程中降低Cas9靶向位点附近的染色体异常结构以及减少基因组范围内染色体易位带来的危害。
知识产权
该项目团队致力于减轻基因编辑中Cas9的负面效应，优化基因编辑策略，实现基因编辑临床治疗的可行性，相关工作发表在Cell Discovery上，且已经递交国内专利。
合作方式
技术许可、技术入股、合作开发。
联系方式
kjkfb@pku.edu.cn
